梯度優(yōu)化在液相色譜方法開發(fā)中是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。有時(shí)，一個(gè)合適的梯度洗脫程序?qū)σ合嗌V分析分離可起到“四兩撥千斤”的作用。然而，許多小伙伴由于梯度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)做得相對(duì)較少，因此誤認(rèn)為梯度優(yōu)化非常復(fù)雜。今天小編就帶大家來揭開反相液相色譜梯度程序的神秘面紗，一探梯度優(yōu)化的究竟。

一、建立梯度方法的原因

Q 為什么要用梯度的方式來洗脫呢？

當(dāng)然，作為分析工作者，如果能以一個(gè)等度的條件完成我們的分離目的，那便是是皆大歡喜的，但實(shí)際情況常常不能如我們所愿。混合樣品組分中，必定存在容易分離和不易分離的組分，保留較弱和保留較強(qiáng)的組分。

我們建立梯度洗脫程序的目的就在于，將容易分離的組分在洗脫能力較弱的流動(dòng)相中實(shí)現(xiàn)盡快分離，而保留較強(qiáng)的組分在色譜柱內(nèi)停留較長(zhǎng)時(shí)間，與鍵合相表面發(fā)生充分的相互作用，盡可能地彼此拉開，后用強(qiáng)洗脫能力的流動(dòng)相洗脫出來，避免洗脫時(shí)間過長(zhǎng)。

二、反相液相色譜體系流動(dòng)相的洗脫能力

Q 前文既然講到了流動(dòng)相的洗脫能力，那么，反相色譜中，如何來判斷流動(dòng)相的洗脫能力呢？

我們可以來看一下下面這張圖：

上圖各位小伙伴應(yīng)該都不陌生，所述的原理即是，在反相體系中，隨著流動(dòng)相的極性不斷增加（水相的比例在不斷增加），流動(dòng)相整體的洗脫能力逐漸減弱，而保留時(shí)間則在逐漸延長(zhǎng)。因此，前文中對(duì)于容易分離的組分，可嘗試在流動(dòng)相極性較大的環(huán)境下將其實(shí)現(xiàn)分離。

同時(shí)，為了提高整個(gè)樣品混合組分的分離度，在整個(gè)梯度程序內(nèi)，也盡可能使用高比例的水相作為梯度洗脫的起始條件。因此，對(duì)于很多小伙伴，在進(jìn)行一個(gè)全新的項(xiàng)目的反相條件方法開發(fā)的時(shí)候，chang用的初始梯度模式便是在0~40min內(nèi)，進(jìn)行一個(gè)95%水相→100%有機(jī)相的線性洗脫。

三、反相液相色譜梯度優(yōu)化中心思路

反相色譜梯度優(yōu)化的中心思路，其實(shí)就是盡可能減弱流動(dòng)相的洗脫能力，從而減少共洗脫的情況。減弱流動(dòng)相洗脫能力y效的方式是更換洗脫強(qiáng)度弱一些的溶劑，或者增減流動(dòng)相中的添加劑。

然而，很多情況下，小伙伴參照既定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，溶劑種類和添加劑的量不便進(jìn)行過多的調(diào)整，這樣的情況下，還有一個(gè)方法可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，那就是減緩流動(dòng)相的變化斜率。我們通過下面這個(gè)案例給大家說明：

通過上圖我們可以看到，在梯度（一）條件下，多潘立酮和雜質(zhì)D出現(xiàn)共洗脫，峰重疊。于是我們進(jìn)行梯度程序的調(diào)節(jié)：

在梯度（二）中，10min時(shí)乙腈的比例為45%，而梯度（一）下10min時(shí)乙腈的比例為60%，并且梯度（二）中的后7min，乙腈的比例也并未繼續(xù)升高至100%，這就使得梯度（二）條件中，每時(shí)每刻乙腈的比例都低于梯度（一），暨每時(shí)每刻流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度都弱于梯度（一），如下圖。如此一來，各雜質(zhì)共洗脫的情況得到改善，結(jié)果就是如圖3所示，8個(gè)物質(zhì)都得到了分離。

四、注意事項(xiàng)

在進(jìn)行方法開發(fā)梯度優(yōu)化的時(shí)候，一定要注意兼容性的問題，包括流動(dòng)相溶劑彼此之間的兼容性，以及流動(dòng)相和樣品的兼容性。

流動(dòng)相溶劑選擇上，h是選擇能夠任意比例互溶的溶劑。若是流動(dòng)相溶劑不方便更換，則需盡量減緩流動(dòng)相的變化速率，給有機(jī)相和水相（鹽相）更多的時(shí)間來互溶。

對(duì)于樣品來說，流動(dòng)相的性質(zhì)一定要注意與樣品溶劑能夠兼容，避免出現(xiàn)在進(jìn)樣后的任意時(shí)刻樣品不溶解、析出的情況。